FITC Annexin V 是一種用于識(shí)別凋亡細(xì)胞的靈敏探針，與帶負(fù)電荷的磷脂表面結(jié)合（Kd 約為 5 x 10^-2），對(duì)磷脂酰絲氨酸 (PS) 的親和力高于大多數(shù)其他磷脂。FITC Annexin V 結(jié)合是鈣依賴性的，如 FITC Annexin V 染色方案中所述，最佳染色需要確定的鈣和鹽濃度。  研究人員應(yīng)注意，F(xiàn)ITC Annexin V 對(duì)貼壁細(xì)胞類型（例如 HeLa、NIH 3T3 等）的流式細(xì)胞術(shù)分析并非常規(guī)測(cè)試，因?yàn)樵诩?xì)胞分離或收獲過程中可能會(huì)發(fā)生特定的膜損傷。然而，之前已經(jīng)報(bào)道了利用膜聯(lián)蛋白 V 對(duì)貼壁細(xì)胞類型進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的方法（Casiola-Rosen 等人和 van Engelend 等人）。

喜樹堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

提供以下協(xié)議作為說明如何在細(xì)胞系 (Jurkat) 上使用 FITC 膜聯(lián)蛋白 V。

材料

1. 制備喜樹堿儲(chǔ)備液（Sigma-Aldrich 目錄號(hào) C-9911）：1 mM DMSO 溶液。

2. Jurkat T 細(xì)胞 (ATCC TIB-152)。

程序

1. 將喜樹堿（最終濃度 4-6 µM）添加到 1 x 10^6 Jurkat 細(xì)胞中。

2. 在 37°C 下孵育細(xì)胞 4-6 小時(shí)。

3. 繼續(xù)使用 FITC Annexin V 染色方案來測(cè)量細(xì)胞凋亡。

FITC 附聯(lián)蛋白 V 染色方案

FITC Annexin V 用于定量確定細(xì)胞群中正在積極經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞百分比。它依賴于細(xì)胞在細(xì)胞凋亡的早期階段失去膜不對(duì)稱性的特性。在凋亡細(xì)胞中，膜磷脂磷脂酰絲氨酸 (PS) 從質(zhì)膜的內(nèi)葉轉(zhuǎn)移到外葉，從而將 PS 暴露于外部環(huán)境。Annexin V 是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對(duì) PS 具有高親和力，可用于鑒定暴露于 PS 的凋亡細(xì)胞。碘化丙啶 (PI) 是一種標(biāo)準(zhǔn)的流式細(xì)胞儀活性探針，用于區(qū)分活細(xì)胞和非活細(xì)胞。具有完整膜的活細(xì)胞排除 PI，而死細(xì)胞和受損細(xì)胞的膜可滲透 PI。FITC Annexin V 染色呈陽性而 PI 呈陰性的細(xì)胞正在發(fā)生凋亡。FITC Annexin V 和 PI 染色呈陽性的細(xì)胞要么處于細(xì)胞凋亡的末期，要么正在發(fā)生壞死，要么已經(jīng)死亡。FITC Annexin V 和 PI 染色均為陰性的細(xì)胞是活的，沒有發(fā)生可測(cè)量的細(xì)胞凋亡。

試劑

1. FITC Annexin V（成分編號(hào) 51-65874X）：每次測(cè)試使用 5 µl。

2. 碘化丙啶 (PI)（組分編號(hào) 51-66211E）是一種方便的即用型核酸染料。每次測(cè)試使用 5 µl。

3. 10X 膜聯(lián)蛋白 V 結(jié)合緩沖液（組分號(hào) 51-66121E）：0.1 M Hepes/NaOH (pH 7.4)、1.4 M NaCl、25 mM CaCl2。對(duì)于 1X 工作溶液，將 1 份 10X 膜聯(lián)蛋白 V 結(jié)合緩沖液稀釋至 9 份蒸餾水。

染色

1. 用冷 PBS 洗滌細(xì)胞兩次，然后以 1 x 10^6 個(gè)細(xì)胞/ml 的濃度在 1X 結(jié)合緩沖液中重懸細(xì)胞。

2. 將 100 µl 溶液（1 x 10^5 個(gè)細(xì)胞）轉(zhuǎn)移到 5 ml 培養(yǎng)管中。

3. 加入 5 µl FITC Annexin V 和 5 µl PI。

4. 輕輕渦旋細(xì)胞并在室溫 (25°C) 黑暗中孵育 15 分鐘。

5. 向每管中加入 400 µl 1X 結(jié)合緩沖液。在 1 小時(shí)內(nèi)通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

設(shè)置流式細(xì)胞術(shù)的建議控制

以下控件用于設(shè)置薪酬和象限：

1. 未染色的細(xì)胞。

2. 用 FITC Annexin V（無 PI）染色的細(xì)胞。

3. 用 PI 染色的細(xì)胞（無 FITC Annexin V）。

其他染色對(duì)照：

應(yīng)使用易于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞系來獲得 FITC 膜聯(lián)蛋白 V 和/或 FITC 膜聯(lián)蛋白 V 和 PI 的陽性對(duì)照染色。重要的是要注意細(xì)胞凋亡和壞死的基礎(chǔ)水平在人群中有很大差異。因此，即使在沒有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況下，大多數(shù)細(xì)胞群也會(huì)包含一小部分細(xì)胞凋亡陽性（FITC Annexin V 陽性，PI 陰性或 FITC Annexin V 陽性，PI 陽性）。

未處理的群體用于定義凋亡和死細(xì)胞的基礎(chǔ)水平。然后通過從處理過的細(xì)胞群中凋亡細(xì)胞的百分比中減去未處理過的細(xì)胞群中凋亡細(xì)胞的百分比來確定已經(jīng)被誘導(dǎo)經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的百分比。由于細(xì)胞死亡是細(xì)胞經(jīng)歷凋亡的最終結(jié)果，處于凋亡后期的細(xì)胞將有受損的細(xì)胞膜，并且 PI 和 FITC 膜聯(lián)蛋白 V 染色呈陽性。因此，該測(cè)定無法區(qū)分已經(jīng)經(jīng)歷過凋亡的細(xì)胞凋亡細(xì)胞死亡和那些因壞死途徑而死亡的細(xì)胞，因?yàn)樵谌魏我环N情況下，死細(xì)胞都會(huì)被 FITC Annexin V 和 PI 染色。

準(zhǔn)備和存儲(chǔ)

在 4°C 下未經(jīng)稀釋儲(chǔ)存，并避免長(zhǎng)時(shí)間暴露在光線下。不要凍結(jié)。

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