實(shí)驗(yàn)原理：

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融。

當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方 法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。

實(shí)驗(yàn)材料

15ml離心管、培養(yǎng)皿、滴管 、酒精燈、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液、PBS、75%酒精、0.25%胰酶、超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、顯微鏡、計(jì)數(shù)板、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、液氮罐、凍存管、凍存液、廢液缸等。

實(shí)驗(yàn)步驟：

一、細(xì)胞凍存

1.吸取傳代后的細(xì)胞懸液，離心，去除培養(yǎng)液，加入凍存液，分裝凍存管（凍存管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為（5～10）×106個(gè)/ml，2ml凍存管中一般放1～1.5ml細(xì)胞）。

2.按步凍存

冷凍保存方法一：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5～-10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。

冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序之程序降溫機(jī)中每分鐘降1～3℃至-80℃以下，再放入液氮長期保存。

二、細(xì)胞復(fù)蘇

1.取出冷凍管，立即放入37℃水浴箱中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。

2.打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中。

3.1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。

4.加適當(dāng)培養(yǎng)液后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，第二天觀察生長情況。

注意事項(xiàng)

1、吸取過營養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時(shí)會(huì)把有害物帶入營養(yǎng)液中。

2、不能用手觸及已消毒器皿瓶口、瓶塞內(nèi)部，吸管前部等所有可能不細(xì)胞接觸的部分，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。

3、開啟、關(guān)閉長有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶時(shí)，火焰滅菌時(shí)間要短。防止因溫度過高燒死細(xì)胞。

4、換液時(shí)傾倒廢液，瓶口不能接觸廢液缸，速度不能過快，防止廢液四濺。

5、吹打細(xì)胞時(shí)，要注意邊角的細(xì)胞是否吹打下來。

6、手或相對(duì)較臟的物品丌能經(jīng)過開放的瓶口上，即不可以在開放容器上方操作。

7、每次操作只處理一株細(xì)胞，以免造成細(xì)胞交叉污染。

8、注意自身的安全，對(duì)于來自人源性或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心。操作過程中，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑例如DMSO，并避免尖銳物品傷人等。

9、從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液。

10、將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，以免凍傷。

11、凍存和復(fù)蘇一般用新配制的培養(yǎng)液。